| 出品公司: | 生物風 |
|---|---|
| 感受態細胞名稱: | BL21(AI) Ultracompetent cells；BL21(AI) |
| 菌種類型: | E.coli |
| 產品規格: | 10X100 微升 |
| 轉化效率: | 大于1X10的9次方 |
| 基因型: | F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA |
| 抗性: | 無抗性 |
| 質粒轉化條件: | 42 ℃熱激 |
| 生長條件: | 37 ℃, 有氧 |
| 用途: | 非毒性蛋白表達。 |
| 儲存條件: | -80 ℃或者更低溫度保存，避免反復凍融。 |
感受態細胞特點和簡介
BL21(AI)是大腸桿菌B/r型菌株(E.coli B/r)。BL21(AI) 來源于BL21菌株，為Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內的降解。在培養基中添加L-阿拉伯糖可誘導araBAD啟動子下游T7RNA聚合酶的表達進而促進目的蛋白的表達。在培養基中添加葡萄糖可抑制araBAD啟動子下游T7RNA聚合酶的表達進而抑制目的蛋白的表達。BL21(AI) 感受態細胞適用于任何以T7啟動子為基礎的表達載體，能夠進行高水平的重組蛋白表達。因為菌株能夠對體內的T7 RNA聚合酶水平進行高效調節，BL21(AI) 感受態細胞能夠表達對其他BL21細胞有毒性或抑制生長的蛋白。普通重組蛋白在BL21(AI) 菌株中獲得產量和其他BL21菌株產量相當；對大部分毒性蛋白，在BL21(AI) 菌株中獲得的產量高于BL21(DE3)pLysS菌株或BL21(DE3)菌株。BL21(AI) 感受態細胞由特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率高達108cfu/μg DNA。
感受態細胞制備方法
生物風在氯化鈣感受態細胞制作方法的基礎上進行了改良，采用最新的二價錳法感受態細胞制備方法，制備得到BL21(AI)超級感受態細胞（Ultracompetent cell）。轉化效率是常規氯化鈣制備法的10倍。
感受態細胞操作方法
1. 取BL21(AI)感受態細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中，置于冰浴中。
注意：一次轉化BL21(AI)感受態細胞的建議用量為 50-100μl，可以根據實際情況分裝使用。應注意所用DNA 體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之一。以下實驗以100μl BL21(AI)感受態細胞為例。
2. 向BL21(AI)感受態細胞懸液中加入目的 DNA (100μl 的感受態細胞能夠被1 ng 超螺旋質粒DNA 所飽和），輕彈混勻，在冰浴中靜置30 分鐘。
3. 將離心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒，然后快速將管轉移到冰浴中，使BL21(AI)感受態細胞冷卻2-3分鐘，該過程不要搖動離心管。
注意：此步驟也可將離心管置于室溫進行，時間不需十分準確，夏季或室溫較高時，可放置5-8分鐘左右；如果室溫較低，可延長時間至8-15分鐘左右。條件允許建議使用 42 ℃ 熱激方法。
4. 向每個離心管中加入900 μl無菌的SOC 或LB 培養基（不含抗生素），混勻后置于37 ℃搖床振蕩培養45 分鐘（150 rpm），目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。
5. 將離心管內容物混勻，吸取100μl已轉化的BL21(AI)感受態細胞加到含相應抗生素的SOB或者LB 固體瓊脂培養基平板上，用無菌的彎頭玻棒涂布器或玻璃珠將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被完全吸收后，倒置平板，37 ℃培養12-16 小時。
注意：涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化質粒總量較多，可取更少轉化產物涂布平板；反之，如轉化的質粒總量較少，可取200-300 μl轉化產物涂布平板；對于連接產物的轉化菌液，可以通過離心（4000 rpm，2分鐘）后倒掉大部分培養液上清，吹打懸浮菌體后，將其涂布于一個平板中。
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存，如果次日的轉化菌落數過少，可以將剩下的菌液再涂布新的培養平板。
感受態細胞注意事項
1. BL21(AI)感受態細胞應保存在-70 ℃，不可反復凍融和放置時間過長，以免降低感受態細胞的轉化效率。
2. 進行轉化操作時，應根據相應的溫度及無菌條件的要求進行。
3. 為防止轉化實驗不成功，可以保留部分連接反應液，以重新轉化，將損失降到最低。
4. 用于轉化的連接產物或質粒的體積不能超過感受態細胞體積的15%.
5. 質粒超過7.5 kb后，隨尺寸的增加轉化效率會下降，質粒的尺寸超過10 kb時，在大腸桿菌增殖過程中也可能會出現質粒缺失現象；
6. 用于轉化的質粒量在0.1 pg~50 ng間的效果最好，超過50 ng質粒時，平板上單克隆數目會增加，但是轉化效率會下降。
7. 42 ℃熱擊時間與離心管的厚度、菌液的體積、轉入片段的大小直接相關，一般建議熱擊60-90秒，熱擊時間不宜超過90秒，否則轉化效率會下降很快；