| 出品公司: | 生物風 |
|---|---|
| 感受態細胞名稱: | Y2HGold Ultracompetent cells；Y2HGold |
| 菌種類型: | E.coli |
| 產品規格: | 10X100 微升 |
| 轉化效率: | 大于1X10的9次方 |
| 基因型: | MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1 |
| 抗性: | 無抗性 |
| 質粒轉化條件: | 42 ℃熱激 |
| 生長條件: | 37 ℃, 有氧 |
| 用途: | 非毒性蛋白表達。 |
| 儲存條件: | -80 ℃或者更低溫度保存，避免反復凍融。 |
感受態細胞特點和簡介
Y2HGold菌株是Clontech公司開發的GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株，MATa型，可直接轉化質粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為：trp1，leu2，報告基因為：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。Y2HGold-GAL4 酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。質粒pGBKT7的篩選標志為TRP1，用于表達DNA-BD (來自酵母轉錄因子GAL4N端1~174位氨基酸)與目標蛋白 (Bait)的融合蛋白；質粒pGADT7 的篩選標志為LEU，用于表達AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4 系統原理：一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域：位于N端1~174位氨基酸區段的DNA結合域 (DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸區段的轉錄激活域 (AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下，BD不與AD結合，將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合，形成 bait融合蛋白 (bait -BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey發生相互作用，就會促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報告基因的轉錄。Y2HGold有四個報告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分別由三種不同的啟動子 (G1，G2，M1)啟動，這三種啟動子只有GAL4識別的17 bp核心區相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發生的概率。此外新報告基因AbAr與以前的營養缺陷報告基因相比具有更低背景的優點，也可以降低酵母雙雜假陽性發生的概率。Y2HGold感受態細胞經特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，pGADT7質粒檢測轉化效率>104cfu/μg DNA。
感受態細胞制備方法
生物風在氯化鈣感受態細胞制作方法的基礎上進行了改良，采用最新的二價錳法感受態細胞制備方法，制備得到Y2HGold超級感受態細胞（Ultracompetent cell）。轉化效率是常規氯化鈣制備法的10倍。
感受態細胞操作方法
1. 取Y2HGold感受態細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中，置于冰浴中。
注意：一次轉化Y2HGold感受態細胞的建議用量為 50-100μl，可以根據實際情況分裝使用。應注意所用DNA 體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之一。以下實驗以100μl Y2HGold感受態細胞為例。
2. 向Y2HGold感受態細胞懸液中加入目的 DNA (100μl 的感受態細胞能夠被1 ng 超螺旋質粒DNA 所飽和），輕彈混勻，在冰浴中靜置30 分鐘。
3. 將離心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒，然后快速將管轉移到冰浴中，使Y2HGold感受態細胞冷卻2-3分鐘，該過程不要搖動離心管。
注意：此步驟也可將離心管置于室溫進行，時間不需十分準確，夏季或室溫較高時，可放置5-8分鐘左右；如果室溫較低，可延長時間至8-15分鐘左右。條件允許建議使用 42 ℃ 熱激方法。
4. 向每個離心管中加入900 μl無菌的SOC 或LB 培養基（不含抗生素），混勻后置于37 ℃搖床振蕩培養45 分鐘（150 rpm），目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。
5. 將離心管內容物混勻，吸取100μl已轉化的Y2HGold感受態細胞加到含相應抗生素的SOB或者LB 固體瓊脂培養基平板上，用無菌的彎頭玻棒涂布器或玻璃珠將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被完全吸收后，倒置平板，37 ℃培養12-16 小時。
注意：涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化質粒總量較多，可取更少轉化產物涂布平板；反之，如轉化的質粒總量較少，可取200-300 μl轉化產物涂布平板；對于連接產物的轉化菌液，可以通過離心（4000 rpm，2分鐘）后倒掉大部分培養液上清，吹打懸浮菌體后，將其涂布于一個平板中。
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存，如果次日的轉化菌落數過少，可以將剩下的菌液再涂布新的培養平板。
感受態細胞注意事項
1. Y2HGold感受態細胞應保存在-70 ℃，不可反復凍融和放置時間過長，以免降低感受態細胞的轉化效率。
2. 進行轉化操作時，應根據相應的溫度及無菌條件的要求進行。
3. 為防止轉化實驗不成功，可以保留部分連接反應液，以重新轉化，將損失降到最低。
4. 用于轉化的連接產物或質粒的體積不能超過感受態細胞體積的15%.
5. 質粒超過7.5 kb后，隨尺寸的增加轉化效率會下降，質粒的尺寸超過10 kb時，在大腸桿菌增殖過程中也可能會出現質粒缺失現象；
6. 用于轉化的質粒量在0.1 pg~50 ng間的效果最好，超過50 ng質粒時，平板上單克隆數目會增加，但是轉化效率會下降。
7. 42 ℃熱擊時間與離心管的厚度、菌液的體積、轉入片段的大小直接相關，一般建議熱擊60-90秒，熱擊時間不宜超過90秒，否則轉化效率會下降很快；